Låt oss ta ett exempel på något coolt som någon gjort med RT-PCR. Det handlar också om ett epigenetiskt fenomen med en ganska obskyr historia. Säg hej till Trofim Lysenko:

Lysenko är känd för att ha varit Josef Stalins favoritbiolog och för att efter att han blivit chef för den sovjetiska vetenskapsakademiens institut för genetik bekämpat klassisk genetik till förmån för sin egen Lysenkoism. Vetenskapliga motståndare förlorade sina jobb och en del deporterades. (Ändå lyckades Dimitrij Belyaev under 50-talet starta domesticeringsexperimentet med rävar på en pälsfarm i Sibirien.)

Lysenkoismen innefattade bland annat ärftliga förvärvade egenskaper — alltså att ärftliga förändringar inte skulle uppstå som genetiska mutationer, oberoende av miljön, utan som svar på förändringar i individens miljö. Var nu gränsen mellan biologi och politik går är inte gott att veta, men evolution genom riktade förändringar som förvärvas under individens livstid var i alla fall ingenting som Lysenko & co var först med eller ensamma om.

Idéer om sådana riktade ärtfliga förändringar brukar kallas Lamarckism, efter Jean-Baptiste Lamarck som levde och verkade under kring sekelskiftet till 1800-talet. (Det är ganska taskigt mot Lamarck att koppla ihop honom med Lysenko, men Lysenko betraktade i alla fall själv Lamarck som en förebild.) Hur som helst, i och med att epigenetiken kommit på tapeten och även en del samtida biologer börjar tänka sig att det skulle kunna finnas sådant arv (vid sidan av det genetiska, den här gången, inte istället för det), har Lysenkos givit upphov till någon sorts biologins motsvarighet till Godwin’s lag. När epigenetik diskuteras kan han leta sig in på ett hörn, så nu har vi stämt i bäcken genom att nämna honom direkt.

Lysenkoismen omfattade i alla fall minst ett faktiskt epigenetisk fenomen. Det kallas vernalisering, och betyder att en del växter kommer blomma snabbare på våren om de utsätts för kyla under vintern. Det är alltså ett av de tillfällen där en epigenetisk signal reagerar på miljön — men, det är fråga om en ärftlighet mellan celler, inte från växt till frö. Vernalisering är alltså en av de de (vanliga) epigenetiska förändringar som stannar inom samma individ och inte gå arv till nästa generation — därför gör den ingen nytta vid växtförädligen.

Efterhand har olika biologer börjat reda ut vilka proteiner och epigenetiska markeringar som ligger bakom vernalisering. Bäst känd är den förmodligen i den bäst kända laboratorieväxten. Säg hej till backtrav (Arabidopsis thaliana):

(Bild från Wikipedia, publicerad av Marko Roepers och Creative Commons-licensierad.)

Den här lilla figuren är alltså en av växtbiologins stjärnor. Och det är nu vi ska komma till den coola tillämpningen av RT-PCR. Försöket beskrivs i en artikel av Heo & Sung, Vernalization-Mediated Epigenetic Silencing by a Long Intronic Noncoding RNA.

Kort molekylär sammanfattning av hur vernalisering aktiveras: Proteinet VIN3 är det som reagerar på kylan. Det kopplar sedan ihop sig med ett proteinkomplex som kallas PRC2 (polycomb repressive complex 2). Polycomb är en grupp av proteiner som ändrar på kromatinets struktur, alltså hur DNA är ihoprullat, och på så sätt kontrollerar genuttryck.

Som tidigare nämnda PRDM9 arbetar det genom att sätta dit metylgrupper på histonerna. PRC2 metylerar histonerna kring genen FLC. FLC står för flowering locus, och har alltså med blomning att göra. Närmare bestämt motverkar den blomning. När histonerna kring FLC metyleras minskar genuttrycket — dess hämmande effekt på blomning motverkas. Växten blommar fortare. Katten på råttan, råttan på repet, VIN3 på PRC2 på FLC. Men det fattas ändå minst ett steg.

PRC2, det histonmetylerande komplexet, kan metylera histoner både här och där, och det är inte klart vad det är som får det att verka just kring FLC. Hur kan ett komplex av proteiner hitta till en viss DNA-sekvens? En del proteiner känner ju igen vissa DNA-sekvenser och binder till kromosomen där just de sekvenserna förekommer; PRDM9 var ett exempel på det med sitt CCTCCCTNNCCAC-motiv. Polycombkomplex, däremot, har visat sig binda till vissa sekvenser i RNA. Om det finns ett RNA som bär på den sekvensen och i sin tur passa på något visst ställe i genomet — då kan Polycombkomplexet binda till RNA:t, som i sin tur binder till kromosomen, och då kan komplexet metylera histoner just på det stället. Ett sådant RNA kan ligga i en icke-kodande del (intron) av genen ifråga kallas long intronic noncoding RNA. Eftersom molekylärbiologer älskar förkortningar kallas det också lincRNA.

Inspirerade av ett par tidigare exempel på sådana RNA-molekyler i samband med Polycombkomplex, letade Heo & Sung efter långa RNA-molekyler som passade FLC-genen. Hur leta efter RNA-molekyler? Med RT-PCR, naturligtvis. De skaffade sig dryga hundra primerpar för att kopiera upp olika icke-kodande delar runt omkring FLC; isolerade RNA och tillverkade cDNA från köldbehandlade växter; och körde sina PCR-reaktioner.

cDNA:t motsvarar alltså de delar av genomet som transkriberas till RNA. När vi vidtagit mått och steg (en bra RNA-isoleringsmetod och behandling med ett DNA-nedbrytande enzym) ska RNA-provet vara hyfsat rent. Omvänd transkription med slumpvisa primers ger oss  cDNA från alla möjliga RNA-molekyler. Om vi sedan får en PCR-produkt från en region kan vi alltså anta att den skrivs av till en RNA-kopia.

Heo & Sung lyckades sedan isolera den RNA-molekyl som PCR-produkterna kom ifrån, ett lincRNA som ligger i FLC:s första intron, alltså i ett icke-kodande gap inne i själva genen. De gav RNA-molekylen namnet COLDAIR. Det ligger också nära en reglerande sekvens (VRE, vernalization response element) som krävs för att vernaliseringen ska fungera. De använde transgena växter med reducerat COLDAIR-uttryck, som åtminstone delvis förlorade förmågan till vernalisering. COLDAIR ska alltså in någonstans i kedjereaktionen vi beskrev ovan. Men det verkar ännu inte klart… Hur aktiveras COLDAIR? Har det kanske med något protein som binder till VRE-sekvensen att göra?

Dessutom är det här faktiskt inte det första ncRNA:t i FLC-trakten. Swiezewski & co hittade flera långa RNA-molekyler som uttrycks från andra änden av genen! (De använde inte RT-PCR utan en DNA-chipmetod.) Deras senaste arbete publicerades förrförra året; deras RNA heter inte COLDAIR utan COOLAIR.

Det får inte vara för enkelt.

Litteratur

Heo JB, Sung S. (2011) Vernalization-Mediated Epigenetic Silencing by a Long Intronic Noncoding RNA. Science 331 ss. 76-79.

Swiezewski S, Liu F, Magusin A, Dean C. (2010) Cold-induced silencing by long antisense transcripts of an Arabidopsis Polycomb target. Nature 462 ss. 799-802.

Amasino R. (2004) Vernalization, Competence, and the Epigenetic Memory of Winter. The Plant Cell 16 ss. 2553-2559.

Caspari EW, Marshak RE. (1965) The Rise and Fall of Lysenko. Science ss. 275-278.