Kategoriarkiv: molekylärgenetik

Epigenetik: gul päls och en svansknyck, de bästa exemplen på epigenetiskt arv

Publicerat i molekylärgenetik av

Om epigenetik bara vore några mekanismer för genreglering skulle det knappast vara ett sådant liv om epigenetiken. SVT:s vetenskapsmagasin skulle inte låta ett par nyblivna föräldrar visa upp sin dotter medan en allvarlig berättarröst pratade om epigenetikens hypotetiska påverkan på barnets lysande framtid. Det är något mer på gång.

Epigenetik är allt som går i arv från cell till dottercell och som inte kan förklaras av DNA-sekvens eller gemensam yttre miljö — och påverkar vilka gener cellen ska uttrycka. Epigenetiska skillnader kan inte (vad vi vet) ändra på proteiners uppbyggnad — de ändrar alltså inte genernas sekvens — men annars kan de potentiellt förändra det mesta i hur cellen fungerar. En förändring i en enda gens uttrycksnivå kan, som vi strax ska se, ha rätt konstiga effekter.

Det finns en rad exempel på ärftlighet som inte låter sig förklaras av DNA-sekvenser eller gemensam yttre miljö, och vi borde återkomma till några av dem. Men det är väldigt få där vi har någon aning om hur det går till och kan knyta det till någon av de epigenetiska mekanismer som beskrivits på molekylär nivå — DNA-metylering till exempel.

Såvitt jag vet finns det två riktigt bra exempel på epigenetiskt arv där någon verkligen lyckats ta reda på vad som försiggår. Båda handlar, kanske föga förvånande, om små gnagare: gula möss och andra möss med en knyck på svansen. Båda handlar dessutom om DNA-metylering och om en särskild kul form av mutation. (Vi har stött på den tidigare, i Craig Venters med flera Mycoplasma-bakterie med syntetiskt tillverkat genom.)

Mössens genom, liksom de flesta andra djur och växters, är nämligen fullt med transposoner: upprepade sekvenser som kodar för gener som kan klippa och klistra i genomet — och sätta in kopior av sig själva! Det är ganska absurt. Hur vi fått alla de här eländiga självkopierande generna kan diskuteras, men en del av dem stammar helt klart från retrovirus. Det hör till retrovirusens livscykel att sätta in en kopia (ett så kallat provirus) av sitt hela sitt genom i värdcellens kromosomer. Om proviruset råkar hamna i könscellerna kan de gå i arv till nästa generation och bli en del av värdorganismens genom. Det är en sjukt osannolik händelse, men uppenbarligen händer det då och då. Det verkar inte finnas något vettigt sätt för värdorganismen att bli av med de här virusresterna. Istället använder den DNA-metylering som ett sätt att hindra dem från att uttryckas.

Så, mössen i fråga har drabbats av bitar av retrovirus sin agouti– respektive axin-gen. I de första mössens fall gör mutationen att de får ovanlig färg. Agouti är namnet på den vanliga bruna färgen, och också namnet på en gen som har med pigmentering att göra. Möss som har genvarianten agouti viable yellow har olika färg, från gula (eller kanske mer gulbruna) till normalbruna. Och — mycket riktigt — färgen går i arv från mor till ungar.

Hur kan vi då vet att det inte är vanligt hederligt genetiskt arv? Morgan & co (1999) studerade inavlade agouti viable yellow-möss som är genetiskt identiska. (Inavlade möss av olika slag finns att beställa på postorder; det är förmodligen både en följd av och anledning till att så många jobbar med möss.)

Nästa mus har en variant av genen axin som kallas axin fused (Rakyan m.fl. 2003). Möss med just den varianten kan ha knyckar på sin svans. Precis som färgen på agouti viable yellow-mössen går antalet böjningar av i arv. Men inte bara från mor till unge, utan också på fädernet. Inte nog med det, DNA-metyleringen finns både i vanliga celler i kroppen (somatiska celler, säger biologer ibland) och i spermier (som ju är könsceller), och skulle alltså kunna gå direkt i arv den vägen.

Särskilt hos däggdjuren har fostret betydligt fler kontaktytor med modern än med fadern, så det finns många möjliga vägar för icke-genetiskt arv. Men när det gäller hanen finns det inte mer än det som ryms i spermien, som bär på kromosomerna men förhållandevis lite proteiner och RNA. Det lustiga är att agouti viable yellow också har samma mönster i spermier som somatiska celler, fast den inte går i arv på fädernet.

(axin fused-möss från Whitelaw-laboratoriet, varifrån båda artiklarna jag refererar kommer; bilden kommer från den här artikeln och är Creative commons-licensierad.)

Sammanfattningsvis är det inte helt olikt fallet med patient P2: han fick genterapi mot betatalassemi men genterapivektorn som var baserad på ett virus, råkade sätta in en genetisk förstärkare mitt i HMGA2-genen. Därmed knöts HMGA2-uttryck till den en ny reglerande sekvens. I viable yellow-mössens fall råkade transposonen sätta in sig i en gen som reglerar pigmentering. Agoutigenens uttryck kopplas alltså till uttrycket av transposonen. Och i och med att transposonen regleras av DNA-metylering regleras aguoti också av DNA-metylering.

Förresten, varför är det en stor grej att metyleringen av axin fused går igen i spermier? När könscellerna bildas nollställs normalt DNA-metyleringen. Epigenetiska markörer har ju med celldifferentiering att göra, och könscellerna ska bilda det nya embryot — ett enda befruktat ägg ska ge upphov till alla celltyper i den nya kroppen. Men all DNA-metylering försvinner inte. Vi har redan tagit upp genetisk prägling — vissa gener metyleras och uttrycks olika beroende på om de går i arv från mamma eller pappa. Och det verkar också finnas vissa lysande undantag, sekvenser som inte får sina metyleringar raderade, bland annat agouti viable yellow och axin fused.

Det är sådana sekvenser — vilka de nu är och hur många nu kan vara — som öppnar för ärftliga DNA-metyleringar. Om de dessutom på något sätt är känsliga för miljöpåverkan öppnar de för ärftliga förvärvade egenskaper. Det är åtminstone teoretiskt möjligt att de kan ligga bakom andra epigenetiska ärftliga saker. Vad är det då som utmärker de här sekvenserna? Ingen vet. Hur som helst, djurs och växters genom är fulla av retrotransposoner och det är mycket möjligt att en del av dem får gener att fungera som de här två musgenerna. Men i så fall har ingen hittat dem än.

Litteratur

Morgan HD, Sutherland HGE, Martin DIK, Whitelaw E. (1999) Epigenetic inheritance at the agouti locus in the mouse. Nature Genetics 23, ss. 314-318.

Rakyan VK, Chong S, Champ ME, Cuthbert PC, Morgan HD, Luu KVK, Whitelaw E. (2003) Transgenerational inheritance of epigenetic states at the murine AxinFu allele occurs after maternal and paternal transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences 100, ss. 2538-2543.

agcgaaaaagtggaaaacagcgaacgcattaacggc (Så går det till, del 4)

Publicerat i molekylärgenetik av

Nu är det ungefär åtta år sedan det mänskliga genomprojektet avslutades. Nu pratas det med jämna mellanrum om den sköna nya värld när alla kommer kunna sekvensera sitt genom. (Vad i hela friden vi ska med våra individuella genomsekvenser till är fortfarande en öppen fråga. Jag föreslår att skriva ut den på ett ungefär trehundra mil långt toalettpapper att släpa runt på.) Samtidigt strömmar det in nya organismer, senast tror jag kakao och jordgubbe, som fått en referenssekvens. Tidningar brukar oftast kalla det ”kartläggning” eller att ”knäcka den genetiska koden”, men de menar nästan alltid sekvensering.

Att ta fram en referenssekvens är fortfarande ett hårt jobb, men det är när den är klar som den verkliga sekvenseringen kan börja. Då blir det lätt för de som är intresserade av någon viss gen eller viss kandidatregion att sekvensera den och hitta intressanta genetiska variationer. Och den moderna sekvenseringen, som snabbt läser av DNA från många slumpvis valda delar av genomet och sedan lappar ihop det till en hyfsat heltäckande sekvens, behöver en bra referenssekvens.

Sådana massivt parallella sekvenseringsmetoder (med namn som Illumina Genome Analyzer, SOLiD och Roche 454) kommer starkt för tillfället. Men Sangersekvensering är förmodligen fortfarande den viktigaste metoden, vid sidan av alternativet pyrosekvensering. (Det finns andra tidigare metoder och den numera typ övergivna Maxam-Gilbertsekvenseringen, men de är drygare.) Alltså — Sangers enzymatiska sekvensering med avbrutna kedjor!

Vi börjar med en primer — precis som i PCR, fast det behövs bara en — en kort DNA-sekvens som passar där vi vill börja läsa. Så kommer DNA-polymeraset, utgår från primern och bygger upp en ny sträng som kopierar den gamla. Den nya strängen byggs upp av nukleotider — en av baserna A, T, G, C som sitter ihop med en sockermolekyl. Så långt allt gott. Det är bara det att vi satt till en andel stoppnukleotider — nukleotider som är kemiskt lite annorlunda och inte går att bygga vidare på.

När polymeraset råkar sätta in en stoppnukleotid är den strängen slut. Stoppnukleotiden är dessutom märkt med en fluorescent molekyl i en av fyra färger, en för varje bas. Resultatet är en blandning av strängar av olika längd som fluorescerar (avger ljus när den blir belyst) i olika färg beroende på vilken bas de slutar med.

Så, om vi bara kan sortera DNA-fragmenten i storleksordning kan vi läsa av sekvensen som en serie av fluorescenta ljus. Hur storlekssorterar vi? Med gelektrofores! Sekvenseringmaskiner brukar använda ett tunnt glasrör med gel och ha en fast detektor som DNA-bitarna passerar igenom. När de åker förbi lyser detektorn på dem med laser och ser vilken färg som lyser tillbaka.

Sedan ritar den ett diagram med en kurva för varje färg, där sekvensen framträder som en bergskedja av toppar i olika färger. (Eller snarare, det gör ett datorprogram på datorn kopplad till maskinen — om någon vet om ett trevligt fritt program för Sangersekvensering, berätta för mig!)

Den här metodens nackdel är att den bara kan sekvensera en ganska kort sekvens i taget, upp till kanske tusen baspar. Början av sekvensen brukar också vara svår att läsa av. För att konstruera en referenssekvens behövs det alltså ohyggliga mängder sekvenseringsreaktioner; det mänskliga genomet är ungefär tre miljarder baser. Å andra sidan går det fort att köra en reaktion, och numera är bara att stoppa sitt prov (till exempel en renad PCR-produkt) i ett kuvert och skicka till något av alla de företag som gör sekvensering för typ 100 kr per reaktion.

(Rubriken är ett exempel på den genetiska koden. Proteiner byggs upp av aminosyror, som motsvarar en trio av baspar i en gen. Trion kallas kodon — och vilka kodoner som motsvarar vilken aminosyra kallas den genetiska koden. ”GCT” står för aminosyran alanin, till exempel. I en annan, inte genetisk utan mänsklig, kod förkortas varje aminosyra med en bokstav ur alfabetet. Rubriksekvensen skapades med webbprogrammet Reverse Translate — nej, jag kan det inte i huvudet. Den kan översättas tillbaka till exempel med Transeq.)

Om genterapi, att sätta in en gen och råka störa en annan

Publicerat i molekylärgenetik av

De flesta ”gener för sjukdomar” är, som vi tidigare konstaterat, genetiska markörer där en variant har ett statistiskt samband med en gen som påverkar risken för en sjukdom på något oftast okänt, sällan helt entydigt, sätt. Men det finns också några få, synnerligen ovanliga, ärftliga genetiska sjukdomar, där en trasig variant av en gen orsakar bekymmer.

Cystisk fibros är en känt exempel — ett trasigt jontransportprotein ger alla möjliga otäcka effekter. Huntingtons sjukdom, där en trasig variant av proteinet huntingtin ansamlas i nervcellerna, är ett annat. När den genetiska grunden för en sådan sjukdom är beskriven är det tyvärr ändå inte alltid klart vad man ska göra med kunskapen. Ibland ger den genetiska grunden en bättre bild av vad det är sjukdomen gör — men ofta är det tvärtom, att sjukdomen är bättre känd än genen, och att det därför är sjukdomsbilden som bidrar med upplysningar om hur genen fungerar. Om det saknade proteinet normalt utsöndras i blodet går det möjligen, som med blödarsjuka eller diabetes, att tillverka det och ge som ersättning.

Men själva genen går det inte att göra något åt, utom med genterapi. Genterapi är precis vad det låter som: att försöka bota genetiska sjukdomar genom att ge patienten nytt genetiskt material — i det enklaste fallet tillföra genen för det protein som är trasigt. Det är en spännande idé som varit på tapeten sedan sjuttiotalet. Det har varit många framsteg sedan dess, men det är ändå svårt; det kommer inte vara ett rutiningrepp inom fem år, om vi säger så.

Fortsätt läsa →

Epigenetik: En gång Lysenko, idag lincRNA

Publicerat i molekylärgenetik av

Låt oss ta ett exempel på något coolt som någon gjort med RT-PCR. Det handlar också om ett epigenetiskt fenomen med en ganska obskyr historia. Säg hej till Trofim Lysenko:

Lysenko är känd för att ha varit Josef Stalins favoritbiolog och för att efter att han blivit chef för den sovjetiska vetenskapsakademiens institut för genetik bekämpat klassisk genetik till förmån för sin egen Lysenkoism. Vetenskapliga motståndare förlorade sina jobb och en del deporterades. (Ändå lyckades Dimitrij Belyaev under 50-talet starta domesticeringsexperimentet med rävar på en pälsfarm i Sibirien.)

Lysenkoismen innefattade bland annat ärftliga förvärvade egenskaper — alltså att ärftliga förändringar inte skulle uppstå som genetiska mutationer, oberoende av miljön, utan som svar på förändringar i individens miljö. Var nu gränsen mellan biologi och politik går är inte gott att veta, men evolution genom riktade förändringar som förvärvas under individens livstid var i alla fall ingenting som Lysenko & co var först med eller ensamma om.

Idéer om sådana riktade ärtfliga förändringar brukar kallas Lamarckism, efter Jean-Baptiste Lamarck som levde och verkade under kring sekelskiftet till 1800-talet. (Det är ganska taskigt mot Lamarck att koppla ihop honom med Lysenko, men Lysenko betraktade i alla fall själv Lamarck som en förebild.) Hur som helst, i och med att epigenetiken kommit på tapeten och även en del samtida biologer börjar tänka sig att det skulle kunna finnas sådant arv (vid sidan av det genetiska, den här gången, inte istället för det), har Lysenkos givit upphov till någon sorts biologins motsvarighet till Godwin’s lag. När epigenetik diskuteras kan han leta sig in på ett hörn, så nu har vi stämt i bäcken genom att nämna honom direkt.

Lysenkoismen omfattade i alla fall minst ett faktiskt epigenetisk fenomen. Det kallas vernalisering, och betyder att en del växter kommer blomma snabbare på våren om de utsätts för kyla under vintern. Det är alltså ett av de tillfällen där en epigenetisk signal reagerar på miljön — men, det är fråga om en ärftlighet mellan celler, inte från växt till frö. Vernalisering är alltså en av de de (vanliga) epigenetiska förändringar som stannar inom samma individ och inte gå arv till nästa generation — därför gör den ingen nytta vid växtförädligen.

Efterhand har olika biologer börjat reda ut vilka proteiner och epigenetiska markeringar som ligger bakom vernalisering. Bäst känd är den förmodligen i den bäst kända laboratorieväxten. Säg hej till backtrav (Arabidopsis thaliana):

(Bild från Wikipedia, publicerad av Marko Roepers och Creative Commons-licensierad.)

Den här lilla figuren är alltså en av växtbiologins stjärnor. Och det är nu vi ska komma till den coola tillämpningen av RT-PCR. Försöket beskrivs i en artikel av Heo & Sung, Vernalization-Mediated Epigenetic Silencing by a Long Intronic Noncoding RNA.

Kort molekylär sammanfattning av hur vernalisering aktiveras: Proteinet VIN3 är det som reagerar på kylan. Det kopplar sedan ihop sig med ett proteinkomplex som kallas PRC2 (polycomb repressive complex 2). Polycomb är en grupp av proteiner som ändrar på kromatinets struktur, alltså hur DNA är ihoprullat, och på så sätt kontrollerar genuttryck.

Som tidigare nämnda PRDM9 arbetar det genom att sätta dit metylgrupper på histonerna. PRC2 metylerar histonerna kring genen FLC. FLC står för flowering locus, och har alltså med blomning att göra. Närmare bestämt motverkar den blomning. När histonerna kring FLC metyleras minskar genuttrycket — dess hämmande effekt på blomning motverkas. Växten blommar fortare. Katten på råttan, råttan på repet, VIN3 på PRC2 på FLC. Men det fattas ändå minst ett steg.

PRC2, det histonmetylerande komplexet, kan metylera histoner både här och där, och det är inte klart vad det är som får det att verka just kring FLC. Hur kan ett komplex av proteiner hitta till en viss DNA-sekvens? En del proteiner känner ju igen vissa DNA-sekvenser och binder till kromosomen där just de sekvenserna förekommer; PRDM9 var ett exempel på det med sitt CCTCCCTNNCCAC-motiv. Polycombkomplex, däremot, har visat sig binda till vissa sekvenser i RNA. Om det finns ett RNA som bär på den sekvensen och i sin tur passa på något visst ställe i genomet — då kan Polycombkomplexet binda till RNA:t, som i sin tur binder till kromosomen, och då kan komplexet metylera histoner just på det stället. Ett sådant RNA kan ligga i en icke-kodande del (intron) av genen ifråga kallas long intronic noncoding RNA. Eftersom molekylärbiologer älskar förkortningar kallas det också lincRNA.

Inspirerade av ett par tidigare exempel på sådana RNA-molekyler i samband med Polycombkomplex, letade Heo & Sung efter långa RNA-molekyler som passade FLC-genen. Hur leta efter RNA-molekyler? Med RT-PCR, naturligtvis. De skaffade sig dryga hundra primerpar för att kopiera upp olika icke-kodande delar runt omkring FLC; isolerade RNA och tillverkade cDNA från köldbehandlade växter; och körde sina PCR-reaktioner.

cDNA:t motsvarar alltså de delar av genomet som transkriberas till RNA. När vi vidtagit mått och steg (en bra RNA-isoleringsmetod och behandling med ett DNA-nedbrytande enzym) ska RNA-provet vara hyfsat rent. Omvänd transkription med slumpvisa primers ger oss  cDNA från alla möjliga RNA-molekyler. Om vi sedan får en PCR-produkt från en region kan vi alltså anta att den skrivs av till en RNA-kopia.

Heo & Sung lyckades sedan isolera den RNA-molekyl som PCR-produkterna kom ifrån, ett lincRNA som ligger i FLC:s första intron, alltså i ett icke-kodande gap inne i själva genen. De gav RNA-molekylen namnet COLDAIR. Det ligger också nära en reglerande sekvens (VRE, vernalization response element) som krävs för att vernaliseringen ska fungera. De använde transgena växter med reducerat COLDAIR-uttryck, som åtminstone delvis förlorade förmågan till vernalisering. COLDAIR ska alltså in någonstans i kedjereaktionen vi beskrev ovan. Men det verkar ännu inte klart… Hur aktiveras COLDAIR? Har det kanske med något protein som binder till VRE-sekvensen att göra?

Dessutom är det här faktiskt inte det första ncRNA:t i FLC-trakten. Swiezewski & co hittade flera långa RNA-molekyler som uttrycks från andra änden av genen! (De använde inte RT-PCR utan en DNA-chipmetod.) Deras senaste arbete publicerades förrförra året; deras RNA heter inte COLDAIR utan COOLAIR.

Det får inte vara för enkelt.

Litteratur

Heo JB, Sung S. (2011) Vernalization-Mediated Epigenetic Silencing by a Long Intronic Noncoding RNA. Science 331 ss. 76-79.

Swiezewski S, Liu F, Magusin A, Dean C. (2010) Cold-induced silencing by long antisense transcripts of an Arabidopsis Polycomb target. Nature 462 ss. 799-802.

Amasino R. (2004) Vernalization, Competence, and the Epigenetic Memory of Winter. The Plant Cell 16 ss. 2553-2559.

Caspari EW, Marshak RE. (1965) The Rise and Fall of Lysenko. Science ss. 275-278.

Vernalization-Mediated Epigenetic Silencing by a Long Intronic Noncoding RNA

Omvänd transkription och komplementärt DNA (Så går det till, del 3)

Publicerat i molekylärgenetik av

Så, med PCR och agarosgel har vi det viktigaste verktyget för att analysera DNA. Men DNA i sig gör ju ingen glad, eller får åtminstone inte särskilt mycket att hända. Först måste generna uttryckas.

(Bild av transkription av Wikipedia-användaren Forluvoft; översatt och något förändrad av mig.)

Det första steget kallas transkription; genen skrivs av till en arbetskopia i form av RNA. Bilden ovan visar huvuddragen av hur det går till: DNA skrivs av med ett RNA-polymeras (den bruna ovalen); de lila och blå ovalerna symboliserar ett komplex av transkriptionsfaktorer, proteiner som binder till början av en gen och får den att uttryckas.

Arbetskopian (den blå strängen i bilden) kallas mRNA, messenger RNA (på svenska kanske budbärar-RNA eller mall-RNA) RNA är en nukleinsyra som är mycket lik DNA — den har en annan sockerart i sin ryggrad (ribos istället för deoxyribos) och använder basen uracil istället för tymin; den parar med adenin precis som tymin, så RNA använder väsentligen samma alfabet. RNA är oftast enkelsträngat, om allt går till som det ska.

RNA:t kommer sedan transporteras ut från kärnan, behandlas på olika sätt, och efter hand brytas ner igen av enzymer som finns i cellen. Men innan dess har det förhoppningsvis hunnit göra sitt jobb. RNA som kodar för gener förs till ribosomen, cellens proteinfabrik, och utgöra mall för proteinsyntes. Andra RNA-molekyler, bland annat de som bygger upp själva ribosomen och en mängd korta genreglerande RNA-bitar (som kallas mikro-RNA) verkar utan att något protein tillverkas.

(Relativt nya resultat tyder på att cellen dessutom tillverkar en massa RNA från olika ställen i genomet som ingen har en aning om vad de skulle kunna vara bra för. Men de lärde, med flera, tvistar om ifall de mätningarna verkligen stämmer. Det borde vi nog återkomma till.)

Vi har alltså goda anledningar att intressera oss för RNA. (RNA är bäst!) När vi vill veta vad som skiljer olika celltyper eller hur celler reagerar på miljöförändringar är det ofta lättare att titta på mRNA än på de proteiner generna ska producera. När vi vill veta hur gener regleras kan vi behöva mäta flera olika sorters RNA. Kan vi använda PCR till det här? Klart vi kan! Men för att kopieringen ska fungera behöver vi DNA, inte RNA. Vi behöver alltså en göra DNA-kopia med vårt RNA som mall; det är som transkription fast tvärt om och kallas alltså omvänd transkription.

I naturen finns det organismer (om de nu kan kallas så) som utför den process en som en del av sin livscykel (om den nu kan kallas så), nämligen retrovirus. HIV och andra virus av den typen har sina genom lagrade i form av RNA. De saknar eget proteinsyntesmaskineri och behöver därför utnyttja värdcellens proteiner och ribosomer för att uttrycka sina gener och bygga proteiner. För att åstadkomma det sätter de in sitt genom i värdcellens kromosomer; de starka reglerande sekvenser virusgenerna bär med sig lurar cellen att börja uttrycka virusgener i massor. De har alltså samma problem som vi — de har RNA och behöver DNA. Därför bär de med sig ett enzym som kallas omvänt transkriptas.

Det är ett enzym med flera funktioner och själva reaktionen är ganska omständig. Liksom ett vanligt DNA-polymeras utgår det från en primer (en kort bit nukleinsyra att börja bygga från) och bygger sedan en ny sträng med den gamla som mall. Den gamla strängen är RNA, men den nya är DNA. DNA:t är komplementär mot RNA-biten — den har alltså samma kod men är uttryckt i motsvarande komplementära baser (C blir G, A blir U och vice versa). Påhittiga biologer har tagit omvänt transkriptas från olika retrovirus, satt in i bakterieceller och renframställer omvänt transkriptas som finns att köpa för dem som behöver.

Viruset använder en primer av tRNA som finns naturligt i cellen och passar in på en bit av virusgenomet. När vi gör reaktionen i provrör, däremot, tillsätter vi olika primers beroende på vilket RNA vi vill kopiera. Är det bara en viss gen kan vi använda en primer bara för den; om det är RNA i allmänhet vi är ute efter kan vi antingen ta en kort slumpvis sekvens som kommer binda till RNA lite var som heslt, eller en primer bestående av en lång sekvens av T (oligo-dT, som det brukar kallas). mRNA som ska bli proteiner får nämligen en lång svans av A:n. (Det här är en liten konstighet cellen håller på med; svansen är användbar för att RNA-molekylen ska transporteras rätt och inte brytas ner så fort.)

Resultatet blir alltså enkelsträngat cDNA: DNA-strängar som är komplementära till RNA. Vilket RNA beror på typen av primer — genspecifika primers ger RNA från en viss gen, oligo-dT-primers ger mRNA i allmänhet, slumpvisa primers ger vilket RNA som helst.

Enkelsträngat DNA är också DNA och duger utmärkt till PCR. Kombinationen av omvänd transkription (RT) och polymeraskedjereation (PCR) kallas RT-PCR. Lagom fantasifull benämning. PCR-produkten kan vi analysera på en gel som vilket DNA som helst, eller använda till något annat.

Vill vi däremot ha dubbelsträngat cDNA, vilket är stabilare och krävs för vissa andra tillämpningar, får vi anstränga oss lite mer. För den som tyckte PCR var ett påhittigt missbruk av naturligt förekommande enzymer, lyssna på det här: Först tillsätter vi RNas H, ett enzym som bryter ner RNA (egentligen har omvänt transkriptas redan den aktiviteten också, men den brukar tas bort från de rekombinanta enzymerna för att hålla RNA-mallen intakt så länge som möjligt); ett DNA-polymeras I (från tarmbakterien och laboratorietrotjänaren Escherichia coli) som bygger upp den andra DNA-strängen med utgångspunkt från de kvarvarande RNA-resterna; och mot slutet ett DNA-polymeras från bakterieviruset bakteriofag T4 som fyller i luckorna som blir kvar i den andra DNA-strängen efter att E. coli-polymeraset är färdigt. Sedan renar vi fram dubbelsträngat cDNA från reaktionsblandningen — kanske med en kolonn eller med en blandning av fenol och kloroform.

Om det ska anses som väldigt fiffigt eller extremt omständigt beror förmodligen på personlig smak och läggning. cDNA får vi i alla fall.

Varför det inte går att fixa barn från två hanar utan att föda upp en chimärhona

Publicerat i cellbiologi, molekylärgenetik av

… och sätta in extra kopior av några mycket viktiga gener i celler från den ena fadern.

Min första bloggpost handlade om möss med två mammor men ingen pappa. Det var faktiskt också en post om epigenetik, även om jag inte använde ordet då — genetisk prägling är nämligen några av våra bästa exempel på epigenetiska mekanismer, närmare bestämt DNA-metylering.

Nåväl, det går hur som helst att få möss att födas som saknar far. Det förekommer inte i naturen, utan är en laboratorieprocess där två äggceller, vara än är genetiskt modifierad, kombineras. En naturlig följdfråga (åtminstone för den som är biolog och/eller lite skruvad): går det att göra något liknande med två hanar? Jag skulle spontant ha svarat nej; eftersom att spermien innehåller så lite måste det behöva finnas en äggcell med i bilden.

Och det är sant, men samtidigt fel. Det krävs en äggcell, men nu har ett gäng påhittiga biologer (Deng m fl. Generation of viable male and female mice from two fathers.) kommit på ett sätt att få fram äggceller från hanar. Detta med hjälp av inducerade pluripotenta stamceller och chimärmöss. Sättet de gått till väga är minst lika omständigt, men det är ett ganska lämpligt ämne  ett år när nobelpriset i medicin gick provrörsbefruktning.

Fortsätt läsa →

Agarosgelelektrofores (Så går det till, del 2)

Publicerat i molekylärgenetik av

Till utseendet är den ena DNA-lösningen den andra lik; det ser ut som lite vatten i ett rör (vilket det såklart till största delen också är). Så, om vi just kopierat upp till exempel en bit av en gen, hur får vi veta om det är något där? Som sagt finns det många mer eller mindre sofistikerade sätt att analysera DNA, men det kanske enklaste och vanligaste är elektrofores i en agarosgel.

Elektrofores betyder att laddade partiklar rör sig i ett elektriskt fält; eftersom olika laddningar attraherar varandra kommer negativt laddade saker att vandra mot pluspolen och positivt laddade saker vandra mot minuspolen. Agaros finns i agar-agar och används i matlagning för att göra olika geléartade rätter. Agaros är (liksom DNA) en polymer, alltså en mycket lång molekyl. I en agarosgel ligger agarosmolekylerna lite kors och tvärs och får stora molekyler att röra sig långsammar än de skulle göra i en vätska. För att analysera DNA gjuter vi ett block av agarosgel, dränker den i en balja med saltlösning (för att leda strömmen ordentligt), stoppar ner DNA och sedan lägger vi på elektrisk spänning.

DNA är negativt laddat och vandrar alltså mot den positiva änden av baljan (så här kan ett litet elektroforeskar se ut). Långa DNA-bitar kommer hindras mer av agarosen och vandra långsammare. Låt oss nu titta på Jackie K:s gelbild (Creative Commons-licensierad) igen:

Randen av svarta rutor allra överst i bilden är brunnar i gelen där DNA-proverna hälls ner. Varje brunn innehåller ett prov som sedan vandrat rakt ner längs med bilden. De ljusa banden är DNA. För att de ska synas innehåller gelen ett DNA-bindande fluorescent färgämne.

Banden som vandrat längst i gelen, längre ner i bilden, är kortast. För att ha något att jämföra med använder vi en så kallad stege, en blandning av DNA-bitar med kända längder. Det är en sådan vi ser i första brunnen till vänster. Efter stegen kommer proverna. Den kortaste DNA-biten är i den fjärde brunnen; den längsta i den första.

Gelen är klar och fin med bara ett band från varje brunn (utom stegen, såklart). Om det är PCR-produkter på gelen betyder det att det är en bra och specifika PCR-reaktioner, som bara kopierar upp en sekvens. (Eller möjligen i värsta fall två olika sekvenser med precis lika långa produkter.) Mer än så kan vi nog inte tolka den här bilden utan att veta vad det är för prover.

Agarosgel duger bra för prover med mycket DNA (PCR-produkter, exempelvis) och för att skilja DNA-bitar som skiljer sig kanske 50-100 baser i storlek. För att separera mindre fragment eller proteiner, som inte är lika långa och skrymmande som DNA och alltså inte hindras nämnvärt av agarosgel, går det att använda gel av polyakrylamid. (Hallandsåsen, någon?) För små mängder DNA finns det elektroforesmaskiner med kapillärer, väldigt tunna rör fulla med gel, som inte kräver så stora mängder prov.

Polymeraskedjereaktionen (Så går det till, del 1)

Publicerat i molekylärgenetik av

Vad är det molekylärbiologer gör — egentligen, alltså rent handgripligen? (Jag brukar säga att det mest går ut på att flytta små mängder vätskor mellan olika rör.) Ifall någon undrar tänkte jag att vi kunde gå igenom några vanliga molekylärbiologiska tekniker. Det kommer alltså inte handla så mycket om ett visst forskningsområde utan mer om några mycket vanliga verktyg.

Molekylärbiologi, förresten? Förledet ”molekylär-” kan sitta på rätt många substantiv, men inom biologi betyder det oftast att DNA och proteiner kommer vara inblandat på något sätt. Min personliga favorit är DNA.

Kort repetition: Deoxyribonukleinsyra (DNA) är den molekyl som lagrar alla cellens proteinrecept (samt några andra recept på användbara RNA-molekyler och en väldig massa onödigt skräp). Koden består av en sekvens av baser, de välkända A, T, G och C.

Polymeraskedjereaktionen (PCR) är en metod för DNA-kopiering i provrör. Den är oerhört användbar i alla möjliga sorters biologi, väldigt vanlig men ibland en smula lynnig. Med PCR går det att välja ut ett kort stycke av en DNA-sekvens. En liten mängd av ett DNA-prov blandas i PCR-reaktionsblandingen, och ifall den eftersökta sekvensen finns där kommer den när reaktionen är klar att finnas i massvis av kopior. Kopiorna kan sedan detekteras på olika sätt.

(Modell av DNA från Wikipedia.)

Alla som sett en DNA-molekyl — och det är förmodligen världens mest avbildade molekyl — vet att den oftast har två strängar som sitter ihop. A, T, G och C binder bara till varandra i vissa kombinationer (A+T och C+G). En dubbelsträngad DNA-molekyl bär alltså på två kopior av samma sekvens, men formulerade på olika sätt. (De sägs inte vara identiska, utan komplementära.)

De två komplementära strängarna är grunden för DNA-kopieringen. I sin första artikel om DNA-molekylens struktur skrev Watson och Crick lite drygt:

It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.

Nå. Det mesta verkar rätt sjävlklart när man vant sig vid det. Men om vi tänker oss att vi kan dela på DNA-molekylen utan att ha sönder den så borde det gå att bygga en ny sträng med de komplementära baserna. Det är så cellerna gör. Och som oftast sker det med hjälp av proteiner.

Enzymerna som gör själva kopieringen kallas DNA-polymeras. En polymer är en stor molekyl som är sammansatt av mindre delar; -as är ett efterled som enzymer brukar bära — enzymet sätter alltså ihop en DNA-kejda av mindre byggstenar som kallas nukleotider.

I labbet använder vi oftast DNA-polymeras från Thermus aquaticus. Det är en bakterie som lever i varma källor och är alltså van vid värme. Upptäckarna Brock & Freeze isolerade den från varma källor i Yellowstone; hur coolt är inte det! Taq-polymeraser, som olika varianter av dess DNA-polymeras kallas, är värmetåliga till skillnad från de flesta proteiner förlorar sin struktur när de blir varma — exempel: äggvita.

Varför behöver det vara varmt, då? Cellen använder ett komplicerat system av olika proteiner för att packa ihop och packa upp sitt DNA. Topoisomeraser rullar upp DNA-molekylen så att polymeraserna kommer åt. Olika stödjeproteiner skyddar den ensamma strängen tills den blivit kopierad. I provröret, däremot, har vi DNA i vattenlösning och då är det mycket enklare — framför allt för att vi har betydligt högre koncentration DNA; om en och annan sträng går sönder finns det tusen åter. För att separera DNA-strängarna värmer vi helt enkelt till typ 95 grader Celsius. För att få dem att para ihop sig igen kan vi bara låta blandningen svalna — lämpligen till en temperatur där Taq-polymeraset är högaktivt, typ 72 grader Celsius.

Det är en bit som fattas: DNA-polymeraset kan inte börja bygga nya DNA-strängar var som helst; det bygger bara vidare på en sträng som redan är påbörjad. Därför tillsätter vi korta DNA-strängar, som kallas primers, som ringar in det område vi vill kopiera. För att primrarna ska kunna binda till DNA-strängen som ska kopieras sänker vi temperaturen en stund innan vi går upp till 72 grader.

Och så upprepar vi, som i PCR-programmet ovan. Vid varje cykel separeras och kopieras DNA-strängarna. Här finns en liten Youtube-video som illustrerar det (men stäng av musiken!):

PCR dyker upp överallt. När vi vill typa någon genetisk markör, sekvensbestämma en gen, klona en gen eller nästan vad som helst annat brukar PCR komma in på något hörn. Men den enklaste DNA-analysen efter PCR är förmodligen elektrofores i en agarosgel. Det får bli del två — men här är en bild på en gel så länge:

(Gelbild från Jackie K alias _intellinuts_. Publicerad på Flickr och Creative commons-licensierad.)

Litteratur

Watson JD, Crick FHC. (1953) A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 4356 ss. 737-738

Brock TD, Freeze H. (1969) Thermus aquaticus gen. n. and sp. n. A Nonsporulating Extreme Thermophile. Journal of Bacteriology ss. 289-297

Om syntetbiologi och artificiellt liv

Publicerat i bioteknik, molekylärgenetik av

Tidigare i år kom det rubriker om artificiellt liv. Det var Daniel Gibson & co, under ledning av Craig Venter, kanske den moderna biologins mest kända ansikte (med viss rätt — de organisationer han leder gör coola projekt och han är en rätt kul talare) som publicerade en artikel om den första cellen med ett helt syntetiserat genom. Det är en extremt imponerande insats, men om vad det betyder i övrigt tvista de lärde (med flera). Det ska vi inte heller ge något uttömmande svar på, utan  fördjupa oss lite i hur det gick till.

För de som har tillgång till prenumerationer finns artikeln att läsa här. Lyssna annars på Venter.

Synthetic biology är ett modeuttryck för tillfället, låt oss skriva syntetbiologi på svenska. Inte för att ge sig på definitionsdiskussionen, men låt oss helt enkelt kalla det en uppdaterad variant av bioteknik — inte alls hela vägen, men ännu ett steg närmare att kunna bygga och bygga om biologiska system efter eget huvud. Det är nämligen inte helt lätt, om nu någon undgått att märka det. Biologiska system är, för att använda Drew Endys uttryck, inte byggda för att vara lätta att förstå och förändra. De är strängt taget inte byggda alls, utan har blivit till genom en lång, irrationell och nyckfull evolutionsprocess. Även om jag vet att mina ingenjörskompisar tvivlar på det ibland — hur kontraintuitiva och illa dokumenterade tekniska system än är så är de ändå konstruerade av ett (mer eller mindre) intelligent människosinne

Drew Endy nämner syntesen av långa DNA-strängar som en central teknik — och det är precis det den här artikeln excellerar i. DNA, vår och alla andra organismers stabila lagringsmedium för ärftlig data, är nämligen i grund och botten en väldigt lång sockermolekyl, som kan framställas på kontrollerad syntetisk väg. Det är alltså det som är syntetiskt i den syntetiska cell Gibson & co har framställt — den första mallen för dess arvsmassa har tillverkats i en DNA-syntesmaskin.

Fortsätt läsa →

Genetisk prägling, eller Varför det inte går att fixa barn av två äggceller utan att först göra en genetiskt modifierad klon av en av föräldrarna

Publicerat i molekylärgenetik av

Prägling är ett ord som jag tror jag lärde mig av Bamsetidningen. Vid en klättertur i ett berg hittar Bamse, Lille Skutt och Skalman ett ägg som kläcks till en gigantisk ödla som präglas på Bamse, vartefter den glatt travar efter honom. Prägling är alltså en form av inlärning där vissa djur lär sig känna igen vilka som är deras föräldrar — och för den delen vilka som är lämpliga att para sig med. Och den kan alltså ibland riktas åt konstiga håll, till exempel mot människor eller döda ting. (Om dinosaurier hade prägling ska jag låta vara osagt.)

Genetisk prägling betyder något lite liknande, nämligen att vissa gener har förmågan att känna igen sina föräldrar, i den betydelsen att det finns någonting som får dem att fungera olika beroende på vilken av föräldrarna de kom ifrån.

Alltså: Vi diploida organismer bär på (med undantag för de som råkat få tre av någon kromosom) två kopior av vårt genom, alltså vår uppsättning kromosomer. (Diploid betyder alltså två kopior. Könscellerna är haploida och har bara en kopia. Polyploidi, många kopior, är vanligt bland växter.) Den ena kopian kommer från mamma och den andra från pappa. I de flesta fall spelar det ingen roll vilken kopia som kommer från vem, utan det viktiga är vilken sekvens genen har.

Men i några fall — kanske inte så några; idag är typ 80 genetiskt präglade gener kända — är ursprungsföräldern helt avgörande. Kopian som kommer från den ena föräldern kommer nämligen inte uttryckas, alltså användas, alls. Vad genen ifråga anbelangar är människan alltså närmast haploid. Vilken av kopiorna som kommer användas och vilken som stängs av beror på genen; i fallet Igf2 är det kopian från pappa som används, och i fallet Igf2r används kopian från mamma, till exempel.

Den här konstigheten förekommer hos människor och möss (de två djur där den studerats mest), andra däggdjur och bland växter. Varför det förmodligen inte finns hos djur som lägger ägg kan vi kanske återkomma till. Först måste vi nog ursäkta den dramatiska rubriken. Vad har det här med barn av två äggceller att göra?

Jo, kunskapen om genetisk prägling stammar delvis från upptäckten att möss som fått båda kopiorna av vissa delar av sina kromosomer från samma förälder inte utvecklas som de ska. När det gäller vissa kritiska gener måste vi ha både en mamma och en pappa. Två kopior från mamma eller två från pappa duger inte. Varför det är så framgår av ovan: om en gen bara uttrycks från kopian som kommer från mamma och båda kopiorna i ett embryo kommer från pappan — då innebär det i praktiken att uttryck av den genen helt saknas — och vad gäller gener som bara uttrycks från pappan, så kommer de överuttryckas istället. (Det kanske kan vara okej för vissa mindre avgörande gener, men tyvärr visar sig flera präglade gener vara viktiga för själva fosterutveckligen.) Det kan förklara varför partenogenes (jungfrufödsel — alltså att en ny individ utvecklas ur ett obefruktat ägg) inte finns bland däggdjur. Avkomman skulle ju då få båda sina kopior av genomet från mamma.

Nu till rubriken! Detta ger oss ett svar på en fråga som dyker upp förvånande ofta: går det inte att skaffa ett barn från två äggceller (eller två spermier), alltså ett barn som även genetiskt har två föräldrar av samma kön? Numera finns det möss som har två mammor och ingen pappa. Hur gick det till? Jo, det behövs såklart något sätt att se till att de där kritiska generna uttrycks i rätt mängd. Tjuvknepet i det här fallet är att den ena musen är transgen — den saknar en gen som kallas H19, ligger strax bredvid Igf2 och är på något ännu okänt sätt inblandad i regleringen av hur Igf2 och några närliggande gener uttrycks. Den förändringen räcker tydligen för att några av musungarna skulle kunna födas och bli vuxna. Om de i övrigt är helt friska förtäljer inte historien (och det är de förmodligen inte).

Det är alltså knappast ett tänkbart sätt att skaffa barn. Men det tyder på att bristen på jungfrufödslar hos däggdjur faktiskt kan förklaras av genetisk prägling, för om bara uttrycket några präglade gener rättas till så fungerar det — åtminstone hjälpligt.

Litteratur

Kono T, Obata Y, Wu Q, Niwa K, Ono Y, Yamamoto Y, Park ES, Seo J-S, Ogawa H. (2004) Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood. Nature 428 ss. 860–864